core facilities

LABORATORIO CORE FACILITIES

Dipartimento Servizi 

Responsabile: Prof. Federico Zara

Localizzazione: Padiglione 2 – Piano terra

Telefono: 010 56362911

PROTEOMICA


Ref.: Dottor Andrea Petretto (andreapetretto@gaslini.org)

In questi ultimi anni, gli studi di proteomica, basati su Spettrometria di Massa ad Alta Risoluzione, hanno rivoluzionato il campo della biologia e della medicina, svelando meccanismi d’interazione prima sconosciuti e mappando quantitativamente le modulazioni proteiche in linee cellulari e tessuti. Le recenti tecniche di preparazione del campione, le nuove tecnologie e i software di ultima generazione consentono la caratterizzazione del signaling cellulare mediante lo studio delle alterazioni dei network proteici e dei pathways cellulari.

L’informazione così raccolta è usata per proporre un modello di studio estremamente innovativo, il Proteotipo. Raramente, infatti la sola informazione genetica ha consentito la comprensione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle malattie, poiché genotipo e fenotipo non sono unicamente legati all’informazione presente nel genoma; la ragione è da cercarsi nel condizionamento ambientale e nei fenomeni che ne derivano (epigenetica).

Al contrario il modello che proponiamo in molte delle nostre collaborazioni si basa sul concetto che ad un genotipo corrisponda un’espressione proteica che si organizza secondo interazioni specifiche e condizionate dall’ambiente – il proteotipo – e che da questo si determini il fenotipo. Quindi, attraverso il proteotipo possiamo spiegare o prevedere il fenotipo, ampliando la conoscenza dei meccanismi legati alla malattia.

Le linee di ricerca, che fanno riferimento al Laboratorio di Proteomica, sono lo studio di diverse patologie – come la prematurità, le malattie renali, la fibrosi cistica, l’oncologia e i meccanismi molecolari che regolano il sistema immunitario – mediante spettrometria di massa, per l’identificazione e la quantificazione proteica dei sistemi complessi.

Il laboratorio, è, quindi, costantemente impegnato nello sviluppo di nuove tecniche di preparazione del campione, di metodi analitici, di analisi computazionale al fine di caratterizzare quantitativamente le differenti espressioni proteiche e proporre modelli d’interazione in reti molecolari complesse. Acquisire queste informazioni consente lo sviluppo sistematico di una ricerca avanzata per il trattamento di tumori, infezioni virali e difetti genetici. La nostra strumentazione è all’avanguardia e consiste in sistemi cromatografici nano UHPLC e Spettrometri di Massa ad altissima risoluzione, basati su tecnologia Orbitrap (OT Fusion Tribrid e OT Velos Pro) della ditta ThermoScientific (Per informazioni relative alle performance analitiche fare riferimento a planetorbitrap.com).

STRUMENTAZIONE PRESENTE E SERVIZI OFFERTI

Proteomica e Trasduzione del Segnale

  • LIT-OT, Orbitrap Velos Pro per la quantificazione ed identificazione di migliaia di proteine associate alla diagnosi/prognosi di malattie. La piattaforma consente di definire il proteotipo, quale prodotto dell’espressione di geni e della loro modulazione in seguito ad esposizione a fattori ambientali (epigenetica) e/o farmacologici.
  • qOT–LIT, Orbitrap Fusion Tribrid per la quantificazione di decine di migliaia di siti di fosforilazione di proteine al fine di identificare segnali di trasduzione attivi in una cellula. Tali segnali si accendono in risposta a stimoli ambientali e/o farmacologici e possono essere alterati nelle malattie, rappresentando nuovi bersagli terapeutici.

System Biology

  • HPC Server IBM System x3750 M4 a 16 Core e Storage IBM Storwize V3700 22 TB per l’utilizzo di software dedicati alla gestione dei Big Data.
  • Cytoscape rappresenta la migliore piattaforma open source per la descrizione e visualizzazione di biological pathways sconosciuti e/o interazioni molecolari inattese fornendo nuovi meccanismi molecolari e funzionali associati alle malattie. Cytoscape è in grado di gestire informazioni ottenute da approcci tecnologici differenti e di integrare dati derivanti da studi di geni, RNA, proteine, metaboliti e farmaci.

NB: a seguito dell’assegnazione del Conto Capitale 2015, è stato pianificato l’acquisto di un nuovo Spettrometro di Massa ad Alta Risoluzione da dedicare a studi di Metabolomica, (in accordo al piano strategico dell’Istituto) per la quantificazione di migliaia di metaboliti, quali prodotti finali dell’espressione genica e proteica. Tale approccio integra informazioni sui processi biologici di malattia, consentendo la valutazione di come stimoli, farmaci, stress e malattie alterino le impronte chimiche dei processi cellulari.

Per l’Accettazione dei Campioni si rimanda al seguente link:

https://docs.google.com/forms/d/1Cy_jVNax8bDRzQWTQ8ANN9ex5z9Yf3RAOI_P3EHfXqM/viewform

PROGETTI PRINCIPALI

Genetica Medica

  • “TMEM16A chloride channel as an alternative therapeutic target in cystic fibrosis: study of its interactome”

Immunologia Clinica e Sperimentale

  • “A label free approach to characterize the interaction of human natural killer cells with polarized macrophages”
  • “Expression of the ligands of activating NK receptors and soluble factor production by tumor cells, CSC, and MSC”

Laboratori Centrali di Analisi, Immunoematologia e Medicina Trasfusionale

  • “Neuroblastoma biochemistry: from metabolites to metabolomics”
  • “Plasma Proteome Profiling”

Nefrologia, Dialisi e Trapianto

  • “Characterization of neutrophil netosis in human lupus nephritis.”
  • “Blood exosome and microvesicles as a potential metabolic effector in preterm newborn infants.”
  • “OMICs technologies, bioinformatic and statistical design, the combined approach for the identification of close biomarker panel in human disease.”

Oncologia

  • “Consistency between genomic and proteomic profiles reveals novel molecular mechanisms of fasting antitumor activity.”
  • “Zoledronic acid boots γδ T-Cell activity in children receiving αβ+ T and CD19+Cell-depleted graft from an HLA-HAPLO-identical donor.”

Patologia Feto Perinatale

  • “Proteomic Study of amnion in preterm and term birth by high resolution mass spectrometry.”

Patologia Neonatale

  • “Immunosuppression and respiratory diseases of the premature infant: identification of early markers through the study of fetal-placental pathophysiology.”

Pediatria II – Reumatologia

  • “Multi-dimensional platform for the classification of undefined systemic autoinflammatory diseases.”
  • “Human monogenic autoinflammatory syndromes (AIDs) and genetic very early onset inflammatory bowel disease (VEOIBD): working models to explore inflammatory players driving mucosal immune homeostasis and IBD onset.”

CITOFLUORIMETRIA E IMAGING CELLULARE

Ref.: Dottoressa Genny Del Zotto (gennydelzotto@gaslini.org)

La core facility di citometria è nata allo scopo non solo di dare supporto alle ricerche già in atto nell’Istituto ma anche di creare nuove collaborazioni con altri Istituti nazionali o esteri e di promuovere le metodiche citofluorimetriche in nuove aree della ricerca.

La facility, dotata degli strumenti più all’avanguardia e di personale costantemente aggiornato, offre una vasta gamma di metodiche citofluorimetriche e di software di analisi adatti alle diverse esigenze degli utenti. È inoltre compito degli operatori fornire supporto ai ricercatori già esperti nel settore e formare i nuovi utenti. Il personale è sempre disponibile a collaborare con i ricercatori nel disegno di pannelli sperimentali e nella scelta dei reagenti più idonei.

STRUMENTI PRESENTI NELLA FACILITY:

CITOFLUORIMETRI ANALIZZATORI:

Gallios (Beckman Coulter)  specifiche dello strumento

LSR-Fortessa x20 (Becton Dickinson)  specifiche dello strumento

CELL SORTER:

FacsAria III (Becton Dickinson)  specifiche dello strumento

MoFlo Astrios EQ (Beckman Coulter) specifiche dello strumento

IMAGING CELLULARE:

Microscopio a fluorescenza Axio Vert A.1 (Zeiss)

Image StreamXMarkII (Merk)  specifiche dello strumento

Microscopio Confocale TCS SP8 Aobs Leica

La facility è in contatto costante con le diverse ditte impegnate nel settore della citometria e, pertanto, sono spesso disponibili in sede, per periodi limitati, strumenti appena usciti sul mercato.

SOFTWARE DI ANALISI A DISPOSIZIONE DEGLI UTENTI: Infinicyt, FlowJo, Kaluza, Summit, AutoGate, Diva7 e Diva8.

STANZA CELLULE

La facility è provvista di una stanza dedicata alle colture cellulari edotata di: cappa a flusso laminare, incubatore, bagnetti termostatati, microscopio rovesciato a fluorescenza e conta-globuli elettronico.

Questa stanza è a disposizione di tutti i ricercatori che necessitano di preparare i loro campioni in sede.

PROGETTI PRINCIPALI

  • Studio di patologie rare quali: la FOP (Fibrodisplasia Ossificante Progressiva), per cui è in atto un progetto per l’immunofenotipizzazione dei pazienti, CVID e la sindrome di Hunter.
  • Immunofenotipizzazione di pazienti con Sindrome nefrosica
  • Studio dei pathway intracitoplasmatici (es: attivazione dei basofili)
  • Sort e single cell sort in collaborazione con diversi gruppi di ricerca dell’Istituto G. Gaslini e dell’Università di Genova
  • Studio di traslocazioni, colocalizzazioni, interazioni cellula-cellula con diversi gruppi di ricerca dell’Istituto G. Gaslini e dell’Università di Genova

PRINCIPALI SERVIZI OFFERTI

  • Analisi multiparametrica fino a 16 parametri
  • Servizio di acquisizione e analisi dei campioni
  • Disegno di pannelli citometrici e preparazione di protocolli sperimentali in accordo con i ricercatori interessati.
  • Servizio di separazione cellulare nelle diverse condizioni: single cell sort, sort di popolazioni rare, arricchimenti con high speed cell sorter
  • Studi di imaging cellulare quali: colocalizzazioni, traslocazioni, sinapsi immunologiche, variazioni di forma, apoptosi, etc…

Lo strumento utilizzato (ImageStreamX II) è in grado di fornire sia un’analisi qualitativa che quantitativa.

NB: Le separazioni cellulari vengono effettuate unicamente dal personale del laboratorio

FILE UTILI

Linee guida per il SORT

Form di prenotazione del sorting

Analisi del ciclo cellulare

Linee guida per la preparazione del campione in citofluorimetria

“Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition)” by Cossarizza A et al. European Journal of Immunology 2019. Oct; 49(10): 1457–1973